1.1 Ames Test Sistemi

  Dr. Bruce Ames tarafından geliştirilen ve Ames testi olarak da adlandırılan Salmonella/mikrozom test sistemi, gen mutasyonlarına sebep olan maddelerin belirlenmesinde yaygın bir kulanımı vardır. Bu teste bakterinin yaşaması için gerekli olan amino asit üretimini yapan histidin geni mutasyona uğratılmış ve bu amino asitin yokluğunda büyüyemiyen Salmonella suşları kullanılmaktadır.

1.2 Bakteri suşlarının genetik özellikleri:

Histidin mutasyonu :

  Her test suşu, histidin operonunun değişik bölgelerinde çeşitli mutasyonlar içermektedir. Bunlar, ya DNA’daki tek bir bazın değişmesi ile ortaya çıkan baz değişimleri yada bir bazın eklenmesi yada çıkarılması ile kendini gösteren çerçeve kayması mutasyonlarıdır. Test edilen bileşiğin neden olduğu mutasyonun esas mekanizması, moleküler düzeyde bu suşlarla gösterilebilir .

  Başlangıçta geliştirilen his- mutantlarının çeşitli kimyasallara karşı duyarlılığını artırmak üzere, bu suşlara aşağıda belirtilen bazı mutasyonlar eklenmiştir.

 

Rfa mutasyonu :

  Bu mutasyon, bakteri hücre duvarının lipopolisakkarit tabakasının kodlayan genlerde meydana gelir. Hücre duvarının lipopolisakkarit bariyerinin kısmen yok olmasını sağlayan rfa mutasyonu sonucu hücre geçirgenliği artarak normalde hücre duvarından geçemeyen büyük moleküllerin hücre içine girişi kolaylaştırılmıştır.

uvrB mutasyonu :

  DNA onarım sisteminde kesip çıkarma(=excision repair) görevini üstlenen enzimi kodlayan uvrB genindeki delesyon sonucu oluşmuştur. UvrB mutasyonu, birçok mutajenin ortaya çıkarılmasında duyarlılığın artmasına neden olur. Ancak, teknik nedenlerden dolayı uvrB geninin kesilerek uzaklaştırılması sırasında bu delesyon biotin (bio) genine kadar uzanmaktadır. Bu nedenle, bakteriler üreyebilmeleri için histidinin yanında biyotinede gereksinim duyarlar.

R faktörü :

  Maddelerin mutasyona yol açıp açmadığını tayin amacıyla S. thphimurium TA 98 ve TA 100 suşlarına pkM 101 R faktörü plazmidi eklenmiştir. PkM 101 plazmidi, bu suşların daha duyarlı olmasından sorumlu olan hata oranı yüksek (error-prone repair)onarım sistemi ile bağlantılı gen ürünlerini içermektedir.

1.3 Kendiliğinden Geriye Dönen Koloni Sayısı :

  Her test suşu, kendine özgü bir frekansla kendiliğinden geriye döner. S. thphimurium TA 98 suşu için kendiliğinden geriye dönen koloni sayısı 20-40, TA 100 suşu için ise 95-190 arasında bulunmuştur.

2. Materyal

2.1 Bakteri suşu:

  -70 0C stok olarak saklanan S. thphimurium TA 100 suşu kullanılmıştır

2.2 Cihazlar:

 

  Çalkalamalı inkkbatör (Certomat H- Sanyo): bakterilerin üretilmesi, İnkübatör( Memmeat): bakterilerin üretilmesi,

(-70 C) derin dondurucu: bakteri suşlarının saklanması,

Hassas terazi (Sarorius, Almanya): agarların ölçülmesi,

Distile su cihazı (GFL, Almanya): distile su üretmek için,

Karıştırmalı ısıtıcı (IKA Labortechnk): üst agarın ısıtılması için,

Vortex (IKA Labortechnk): bakterilerin ve maddelerin karıştırılması,

Mikropipetler (Eppendorf, Almanya): bakteri ekimi sırasında,

2.3 Kimyasallar

3. Metod

3.1 Genetik Kontroller:

  S. thphimurium test suşlarının orjinal mutasyonlara sahip olup olmadıkları kontrol edilir.

  Histidin gereksinimi: Test suşlarının gecelik kültürlerinden öze ile alınan örnekler, nütrient agarlı plaklara tek koloni şeklinde ekilir. 37 oC de bir gecelik inkübasyondan sonra üreyen tek koloniler, steril kürdanlarla alınarak histidin/biyotin içeren ve sadece biyotin içeren minimal glukoz agarlı plaklara çizgi testi yöntemiyle ekilir. Suşların histidin varlığında üreyip, histidin yokluğunda ürememleri, his- karakterini doğrulamaktadır.

 

  R faktörünün kontrolü: Test suşlarının gecelik kültürlerinden öze ile alınan örnekler, nütrient agarlı plaklara tek koloni şeklinde ekilir. 37 oC de bir gecelik inkübasyondan sonra üreyen tek koloniler, steril kürdanlarla alınarak histidin/biyotin/ampisilin içeren minimal glukoz agarlı plaklara çizgi testi yöntemiyle ekilir. R faktörü içeren suşlar ampisilinli plaklarda ürerken, R faktörü içermeyen suşların aynı plaklarda üremediği gözlenir.

  uvrB mutasyonunun kontrolü: Test suşlarının gecelik kültürlerinden öze ile alınan örnekler, nütrient agarlı plaklara tek koloni şeklinde ekilir. 37 oC de bir gecelik inkübasyondan sonra üreyen tek koloniler, steril kürdanlarla alınarak nütrient agarlı plağa çizgi testi yöntemiyle ekilir. Bu plaklardan bir tanesi kontrol plağı olarak kullanılır, diğeri ise kapağı açılıp 15 watt’lık germisidal UV. Lambası altında 33 cm uzaklıktan 8 sn. süreyle ışınlanır. Kontrol plağı ve UV’ye maruz bırakılan plak, 37 oC de bir gece inkübe edilir. UvrB delesyonu taşıyan suşların kontrol plağında üreyip, UV ile ışınlanmış plaklarda ise üremediği gözlenir.

3.2 Kendiliğinden geriye dönen koloni sayısının kontrolü:

  Test suşlarının, histidinsiz ortamda üreyebilmelerine yol açan kendiliğinden geriye dönüş, mutajenite deneylerinde rutin olarak ölçülüp ve her plakta kendiliğinden geriye dönen bakteri sayısı olarak ifade edilir. Kendiliğinden geriye dönüş frekanslarını saptayabilmek için minimal glukoz agarlı plaklar hazırlanır. %0,6 Difco agar, % 0,5 NaCl içeren steril 100 ml’lik yumuşak agar 45 oC lik su banyosunda eritilerek üzerine steril 0,5 ml L-histidin HCl/ biotin çözeltisinden 10 ml eklenir ve 2’şer ml olacak şekilde steril tüplere dağıtılır. Bu tüplere her suşun gecelik kültüründen 0,1 ml eklenir ve minimal glukoz agarlı plaklara dökülüp dağılması sağlanır. 37 oC de 48 saatlik inkübasyondan sonra geriye dönen kolonilerin sayımı yapılır.

 

3.3 Master plakların hazırlanması :

  Genetik işaretleri doğrulanan suşlar histidin/biotin/ampisilin içeren plaklara ekilir. Bu plaklar +4 oC de iki ay süre ile saklanabilmektedir.

  1. Sitotoksik Etkinin Saptanması: Salmonella/mikrozom test sisteminde kullanılan test bileşiklerinin, bakteri için öldürücü olmayan dozlarının saptanabilmesi amacıyla üst agara 0,1 ml uygun derişimde bakteri kültürü ve en fazla 0,1 ml olacak şekilde değişik miktarlardaki test bileşiği eklenir. Karışım, nütrient agarlı plaklara dökülerek, plaklar 37 oC de bir gece inkübe edildikten sonra koloni sayımı yapılır. Kontrol plağındaki koloni sayısıyla, test bileşikleri ilave edilmiş plaklardaki koloni sayıları karşılaştırılarak sitotoksik doz saptanır. Mutajenite deneylerinde, kimyasal bileşiklerin sitotoksik olmayan dozları kullanılmaktadır.

  2. Test Edilen Kimyasal Bileşiklerin Mutajenik Etkilerinin Saptanması: Plak inkorporasyon testinde, histidin ve biotin eklenmiş 45 oC deki 2 ml lik üst agara, test suşu kültüründen 0,1 ml, test edilecek kimyasaldan 0,1 ml eklenip düşük hızda 3 sn vortekslenerek oda sıcaklığındaki minimal glukoz agarlı plaklara yayılır. Üst agarın plağın bütün yüzeyine donmadan yayılmasını sağlamak için karıştırma, dökme ve yayma işlemlerinin tümü 20 saniyeden az bir sürede yapılır. Her deneyde, pozitif mutajenler kullanılarak rutin olarak, pozitif mutajenik etki kontrolleri yapılır.

  3. Sonuçların Değerlendirilmesi: Salmonella/mikrozom test sisteminde, bir maddeye mutajen denilebilmesi için histidin prototroflarının sayısının kendiliğinden geriye dönen koloni sayısının en az iki katı olması gerekmektedir. Bununla birlikte bu sayı kendiliğinden geriye dönen koloni sayısının iki katından az olup, doza bağlı bir artış söz konusu olursa, bu durumda da bu maddeye mutajen denilebilmektedir.

4. Sonuç

  TA 100 Salmonella typhimurium test bakterilerinin orjinal mutasyonlara sahip oldukları tesbit edildi. Bakterilerin pKM 101 plasmidi taşıdıkları ampisilinli ortamlarda üretilerek saptandı. Nutrient agar plaklarına çizgi ekimi yaparak bakterilerin uvrb mutasyonu taşıdıkları saptandı.

 

  Tekstil boyası olarak kullanılan 6 farklı boya maddesinin mutajenik etkisi olup olmadığı baz çifti mutasyonuna neden olan mutajenleri tayin eden TA 100 suşu kullanılarak araştırıldı.

  Boya örneklerinin sitotoksik özelliği olup olmadığı sitotoksisite çalışmasıyla saptandı. Mutajenite testi sırasında mutajenite etkisi dogrulanan Sodyum Azid maddesi pozitif kontrol olarak kullanıladı.

  Ames test sistemine göre elde edilen test sonuçları Tablo 1’ de verilmiştir.

Kimyasal Madde	Koloni Sayısı	Ames
1.Nolu madde	408	KM (Kuvvetli Mutajen)
2.Nolu madde	260	MD (Mutajen Değil)
3.Nolu madde	245	MD (Mutajen Değil)
4.Nolu madde	309	ZM (Zayıf Mutajen)
5.Nolu madde	221	MD (Mutajen Değil)
6.Nolu madde	302	ZM (Zayıf Mutajen)
Üst mutajenite sınırı		309
Ortalama Mutajenite sınırı		336
Alt mutajenite sınırı		282

Tablo 1. Boya maddelerinin TA100 suşuna göre koloni sayıları ve değerlendirme tablosu

  Bu çalışmada tekstil fabrikaları tarafından kullanılan boya meddelerinin mutajenik etkileri Ames test ile araştırıldı. Test edilen kimyasallardan bir tanesi kuvvetli mutajen bulunurken diğer ikisinin zayıf mutajen ve geri kalan üç tanesinin mutajen olmadığı tespit edilmiştir. Sonuçlara göre kullanılan boya maddelerinin üçünün mutajen etki göstermesi çok önemli bir tehlike yaratmaktadır. Bu boya maddeleri fabrikadaki kullanımından sonra fabrika atık suyu olarak anasu kütlelerine veya onlara ulaşan akarsulara karışarak bu yaşama ortamlarında yaşayan canlılığın temel yapı taşı olan DNA’yı etkilemektedir. Bu yolla dünyamızda var olan ve doğal sulardaki kimyasal kirlenmenin yaşamsal ilişkiler açısından ,insanlar içinde çok önemli ve değerli olan pek çok canlı türünün sağlığını hatta varlığını tehdit ettiğini dolayısı ile ekosistemimizin dengesini bu derece etkileyen bir durum olduğunu göstermektedir.

  Ames testi boyaların mutagenitesinin tespiti için basit, çabuk ve ucuz uygulanabilir bir test olmakla beraber, boya maddelerinin insan üzerinde oluşturabileceği bozuklukları ve sebep olabileceği etkileri tahmin etmek açısından önemlidir.

6. Kaynaklar

*  Fatih Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, 3.sınıf öğrencileri