Kan Lekeleri:

Kan lekeleri, bir müessir fiil esnasında vücutta açılan bir yaradan akan kan ile meydana gelebileceği gibi, bir müessir fiile bağlı olmadan da ağız, burun, kulaklar, vajen, penis ucu ve anüs gibi deliklerden akmak suretiyle de meydana gelebilir.

Kan lekeleri, taze iken parlak kırmızıdır ve kumaşın her lifi kuru pıhtı ile çevrilmiş olup, küçük pıhtı parçaları kurumuş jel gibi olmuş ve giysi ya da kumaşın lekeli kısmının liflerinin arasına girmiştir. Güneş ışığında pıhtılar koyu kırmızı, değişken ışıkta (lamba ışığında) ise parlak, yarı şeffaf, koyu kırmızıya çalan bir renkte görünürler. Reçel ve meyva suyu lekeleri ile demirden yapılmış eşya (silahlar, bıçaklar vb.) üzerindeki pas lekeleri de, benzer görünüm verebilirler (15). Lekeler, koyu renkli veya siyah giysi ya da kumaş üzerinde bulunduğunda görülmeyebilirler, ancak leke kan lekesi ise sertleşmiştir ve yansıyan ışıkta kurumuş pıhtı nedeniyle parlak görülebilir (34). Kan içinde bulunan albüminlerin pıhtılaşması nedeniyle, ince kumaşlarda hafif bir sertlik oluşur (24). Leke eskimiş ise koyu kırmızı, esmer, siyahımtırak bir renkte görülür. Açıkta kalmış bir kan lekesi, 8-10 saat içinde hemoglobinin hematine dönüşmesi nedeniyle esmerleşir (2). Lekenin rengi, yaşına, miktarına ve üzerinde bulunduğu materyalin cinsine bağlı olmakla birlikte, sadece rengine bakarak lekenin yaşını söylemek pek mümkün değildir. Eğer lekenin bulunduğu materyal beyaz renkli ise, fiziksel inceleme için elverişlidir, ancak mavi, siyah, kahverengi gibi koyu renkli bir materyal üzerinde ise ve kurumuşsa, laboratuvar incelemesi olmadan pek fazla fikir vermez. İpekli kumaşlar lekeyi tamamen emerken, yünlü kumaşlar lekeyi pek fazla emmezler. Kokuşma halinde ise leke, balık pulları gibi kabarık, parlak ve yer yer yarıklı bir şekil arzeder. Canlıdan akan kan yıkansa bile, bulaştığı yerden kolay kolay çıkmaz, ancak ölü kanı yıkandığında çabuk temizlenir (24). Kan lekelerinin görünüşü, şekli, boyutu ve etrafındaki eşyalarla olan ilişkisi, olayın oluşu hakkında son derece önemli fikirler verebilir (34). Müessir fiillerde kanın fışkırma veya damlama suretiyle akma şekline, düştükleri yüzeyin niteliğine, açısına, kanın akma yönüne göre biçimleri farklıdır. Dikey olarak herhangi bir yere düşen kan damlası yuvarlak şekillidir. Damlanın düşme mesafesine göre leke etrafında girintili çıkıntılı ve küçük küçük damlacıklar oluşur. Düşme yüzeyinin eğikliği ne kadar fazla ise, leke o oranda ovalleşir. Meydana gelen leke şekilleri de olayın aydınlatılması bakımından önemlidir (2, 24, 25, 34, 37).

Olay yeri leke şekli

Laboratuvarda yapılacak incelemeler için, leke taşınabilir bir eşya üzerinde ise, olay yerinden eşyanın tümü alınarak, eğer leke tazeliğini koruyorsa ve miktar olarak fazla ise bir pipet kullanılarak temiz bir tüp veya şişe içine konulur. Eğer leke eski, birikmiş, kurumuş durumda ise ağız kısmına el değmemiş bir bıçak veya spatül ile kazınarak bir petri kutusuna aktarılır. Leke sıvanma tarzında, kazınarak alınamayacak bir durumda ise, bir pens ile steril olarak alınan pamuk, serum fizyolojik ile ıslatıldıktan sonra leke üzerine bastırarak sürtülmek suretiyle lekenin pamuğa geçmesi sağlanır. Eğer leke toprak, alçı, cilasız tahta, halı, tüylü kumaşla kaplı koltuk ve benzeri taşınmaz ve emme özelliğine sahip eşya üzerinde ise lekenin en yoğun olduğu bölge kesilerek veya kazınarak alınabilir. Alınan leke veya lekelerin alındığı yer, o günün tarihi ve ne amaçla alındığı mutlaka kaydedilmelidir. Leke, grup tayini yapılamayacak kadar küçük veya az ise, üzerine serum fizyolojik, %10’luk potasyum siyanid, %10’luk gliserin veya zayıf amonyak solüsyonlarından biri damlatılmış bir süzgeç kağıdına emdirilerek elde edilen ekstraksiyonla (Taylor usulü) sadece kan olup olmadığı araştırılabilir (2, 6, 13, 24, 37).

Kan Lekesi Şüphesinde Araştırılması Gereken Hususlar

1) Leke kan lekesi midir?

2) Leke kan lekesi ise cinsi nedir? (İnsan kanı hayvan kanı ayırımı)

3) Leke insan kanı ise vücudun neresinden gelmiştir? (Burun, adet kanı, yara, çocuk düşürme, mideden gelme v.s.)

4) Kan lekesinin kadına mı, erkeğe mi ait olduğunun tespiti,

5) Kan lekesinin yaşı.

6) Kan lekesinin grubu

Lekenin Kan Lekesi Olup Olmadığının Tespiti

Eskimiş kan lekeleri bazen pas lekesi, bazen kırmızı renkteki meyva suları ve bazen de kırmızı mürekkep lekeleri ile karışabileceğinden, alınan bir leke üzerinde ilk yapılacak işlem, lekenin kan lekesi olup olmadığının tesbitidir. Bunun için de ihtimali reaktifler ile kan olup olmadığı hakkında bir fikir sahibi olunduktan sonra, kati reaktifler ile sonuca gidilir.

İhtimali reaktifler, olay mahallinde leke yerinden alınmadan da uygulanabilir. Çok eski olmayan lekelerin üzerine serum fizyolojikle ıslatılmış süzgeç kağıdı tatbik edilerek incelemek mümkün ise de, pratikteki değeri pek fazla değildir. Çünkü eskimiş lekeler kolay kolay süzgeç kağıdına geçmezler. Ancak kırmızılığını koruyan bir lekenin süzgeç kağıdına geçirilerek ihtimali reaktiflerin uygulanmasından bir sonuç alınamıyorsa, lekenin kan lekesi olmadığı veya yapılacak ileri tetkiklerden yarar beklenemeyeceği düşünülür. Oldukça eski izlenimi veren lekeler üzerinde % 3'lük hidrojen peroksit tatbiki genellikle iyi sonuç vermekle beraber, hidrojen peroksit yapılacak ileri incelemelerin hassasiyetini yok ettiği için, leke miktarı az ise bu işlemden vazgeçilmelidir. Çok eski olduğu görünümü veren lekelerde, sadece hematin teşekkül etmiş eski lekelerle reaksiyon veren Luminol solüsyonu, karanlık bir yerde leke üzerine damlatılır veya spreylenir. Eğer leke kan lekesi ise parlak bir refle verir. Taze lekelerde henüz hematin teşekkül etmediğinden, bu reaktiften sonuç alınamaz. Bu sözü edilen iki metot da olay yerinde kullanılacak metotlardan olup, negatif sonuç alındığında araştırma materyali alınmasına gerek kalmaz (37).

Laboratuvarda ise Adler reaktifi, Lokomalaşit reaktifi, Mayer reaktifi, Orthotolidine test, Luminal test, Van Dean reaktifi gibi ihtimali reaktifler ile pozitif sonuç alındığında ve elde yeterli miktarda leke varsa kati reaktiflere geçilir. Bunlar da, Hemin billurlarının oluşturulması, Hemokromojen kristallerinin teşekkül ettirilmesi, Bromhidrat hematin billurlarının oluşturulması, kan lekesinin spektroskopik, mikrospektroskopik muayenesi, kromodensasyon testi, kromatografi testi ve elektroforez metodudur (6, 15, 24, 25, 33, 37).

a)İhtimali Reaktifler

Bu reaktiflerin esası, leke içindeki peroksidaz enzim aktivitesinin gösterilmesine dayanır (2, 30). İhtimali reaktif olarak seçilen testler, kan lekesinin düşük konsantrasyonlarında hassas, kullanımı kolay, güvenilir olmalı ve hızlı sonuç vermelidir (7). Bu reaktiflerin en büyük sakıncası, kan lekelerinde insan kanı lekesi olup olmadığının tespitinde kullanılan serolojik testlerin ve ABO kan grubu testlerinin reaksiyon verme özelliklerini inhibe etmesidir (36). Örneğin, Lökomalaşit yeşili ile kontamine olmuş kan lekelerinde, DNA düzeyinde kimliklendirme yapılmasının mümkün olmadığı bildirilmektedir (30).

1.Adler (Benzidin) Reaktifi

a) 95°'lik alkolde doymuş Benzidin eriyiği, reaksiyonu kolaylaştırmak için hidrojen peroksitle beraber kullanılır. Leke kan lekesi ise mavi renk verir (25).

b) 1 g Benzidinin 10 cc % 50'lik Glasiyal asetik asit içerisinde çözülmesi ile elde edilen bu reaktifin tatbiki için ayrıca % 20 volümlük hidrojen peroksite ihtiyaç vardır. Hazırlanırken reaktifin içine 30 cc % 3'lük hidrojen peroksit eklenebilir. Ancak Hidrojen peroksitte meydana gelen değişiklik nedeniyle reaktif çabuk bozulduğundan ayrı ayrı kullanılması daha uygun olmaktadır (37).

Adler reaktifinin uygulanabilmesi için, öncelikle lekenin maserasyona tabi tutulması gerekir. Maserasyon için lekeli materyalden bir miktar alınıp, ufak parçalara kesilerek bir tüpe konulur, üzerine lekenin miktarı göz önüne alınarak bir miktar serum fizyolojik damlatılır. Lekenin, üzerinde bulunduğu materyalden serum fizyolojiğe geçmesi için bir süre beklenerek maserasyon sağlanır. Maserasyon süresi lekenin eskiliğine bağlıdır. Bir haftaya kadar olan lekeler 3–4 saat içinde serum fizyolojiğe geçer. Daha eski lekelerin eskilik derecelerine göre daha uzun süre bekletilmesi gerekir. Eğer araştırmada acil bir durum söz konusu ise, eski lekelerin üzerine birkaç damla % 3’lük KOH (potasyumhidroksit) damlatılarak lekenin serum fizyolojiğe daha çabuk geçmesi sağlanır. Birkaç damla gibi az bir miktar KOH Adler reaktifinin terkibini bozmaz. Elde edilen maserat süzgeç kağıdına damlatılarak kullanılır.

 

Adler reaktifinin uygulanışı iki şekilde olabilir: Birinci şekilde beyaz bir süzgeç kağıdı üzerine birkaç damla reaktiften ve hidrojen peroksitten damlatıldıktan sonra, bu kağıt leke üzerine tatbik edilir veya süzgeç kağıdı üzerine lekeden damlatılarak reaktif ve hidrojen peroksit ilave edilir. İkinci şekilde ise lekeli maserattan bir tüpün içerisine birkaç damla damlatılıp üzerine bir iki damla reaktif ve hidrojen peroksit ilave edilir. Reaktif damlatıldıktan hemen sonra yeşil, 10 dakika sonra mavi bir rengin meydana gelmesi lekenin kan lekesi olduğunu düşündürür. Ancak buradaki en önemli nokta hidrojen peroksidi damlatmadan önce bir müddet beklemek gerektiğidir. Eğer bu arada mavi renk oluşursa bu test değersiz kabul edilir. Çünkü mavi rengin oluşumu, ortamda oksitleyici madde bulunduğunu gösterir, ama leke, kan lekesi değildir. Kontrol amacı ile lekesiz kısımdan alınan bir parça da aynı işleme tabi tutulmalıdır (34). Cox (1991)’un 1/10.000’lik dilüsyonda 1 saniyede, 1/1.000.000’luk dilüsyonda 20 saniyede pozitif reaksiyon verdiğini bildirdiği bu reaktif, literatüre göre 1/500.000 oranında hassastır. Benzidin reaktifi, potasyum ferrosiyanit, potasyum kromat, lugol eriyiği, tenturdiyod, bikromat, hipoklorit, formalin, sodyum tiosülfat, kurşun süperoksit, aseton, magnezyum klorit, demir oksit, demir klorit, potasyum permanganat, domates, erik, şeftali, salatalık, elma, soğan, sarımsak, armut, karpuz suları ile, kuru fasülye, yeşil ve kırmızı mercimek, buğday, arpa unları ve deterjan, sinek pisliği, feçes gibi oksitleyici maddelerle de müspet sonuç vermektedir (2, 6, 7, 13, 19, 26, 31, 32, 37). Benzidin testi, yıllardan beri adli tıp laboratuvarlarında lekenin kan lekesi olup olmadığının araştırılmasında büyük bir güvenle kullanılmıştır. Ancak günümüzde, bu reaktifin kanserojenik özellikleri olması nedeniyle bazı ülkelerde yasaklanmıştır (7, 16, 17, 30). Bu kanserojenik özelliği nedeniyle kullanılmayan benzidin testinin yerine geçecek bir test araştırılmış ve tetrametilbenzidin kullanılmaya başlanmıştır (7).

2. Loko-Malaşit Reaktifi:

1 g Lokobaz malaşit yeşili üzerine 100 cc glasiyal asetik asit ve 150 cc saf su ilave ederek reaktif hazırlanır. Reaktifin kullanılabilmesi için ayrıca hidrojen peroksit ilave edilmelidir. Hidrojen peroksit ilave edildikten sonra reaktif kısa bir süre içinde bozulduğundan kullanılacağı zaman reaktiften 8 cc alınır ve üzerine % 1'lik Hidrojen peroksitten 2 cc ilave olunarak kullanılır. Bu karışım ancak 8 gün süreyle bozulmadan kalır.

Reaktif, Adler reaktifinde olduğu gibi uygulanır. Leke, kan lekesi ise, bir dakika içinde mavi–yeşil renk meydana gelir ve bu renk 10 dakika sonra yeşil renge dönüşür. Bu reaktif, potasyum kromat, lugol mahlülü, tenturdiyot, potasyum permanganat, bikarbonat, demir sülfat, kurşun süperoksit, aseton, aliminyum sülfit, sülyen boya, bronş ifrazı, kiraz suyu ile müspet sonuç verir. Reaktifin hassaslığı konusunda yapılan çalışmalarda Grodsky ve ark. 1/100.000 olarak bildirmişse de Cox (1991) bu oranı 1/5.000 olarak göstermiştir (6, 7, 15, 33, 37).

 

3. Kastle–Mayer Reaktifi:

Reaktif 2 g fenolftalein, 20 g Potasyum hidroksit, 20 g çinko tozu veya talaşı, 100 cc Distile su ile karıştırılarak elde edilir.

Kırmızı renkli bu karışım yaklaşık 40 dk kaynatılınca rengi tamamen açılır ve soğuyunca süzgeç kağıdı ile süzülerek renkli bir şişe içinde saklanır. Reaktifin reaksiyon vermesini kolaylaştırmak için %20 volümlük hidrojen perokside ihtiyaç vardır.

Bir saat camı veya tüp içine konulmuş bir kaç damla leke solüsyonunun üzerine, önce bir iki damla reaktif, sonra da aynı miktarda hidrojen peroksit damlatıldığında, bir kaç saniye içinde açık kırmızı–pembe renk meydana gelirse, sonuç müspet olarak kabul edilir (25, 37). Ancak, hidrojen peroksit damlatılmadan önce, kırmızı rengin meydana gelmediği teyit edilmelidir. Hidrojen peroksit damlatılmadan önce kırmızı rengin ortaya çıkması, ortamda oksitleyici maddelerin bulunduğunu gösterir. Bu durumda leke, kan lekesi değildir (34). Bu testin 1/1.000.000 oranında hassas olduğu bilinmektedir. Cox (1991) da yaptığı çalışmalarda bu testin, 1/1.000.000 dilüsyondaki kan solüsyonu ve kanın 1/10.000’lik dilüsyonuyla lekelenmiş filtre kağıdı ile koton kumaşta, pozitif sonuç elde ettiğini bildirmiştir.

Mayer reaktifi, bakır, albümin, idrar, meni lekesi, bazı taze meyve suları ile müspet sonuç verebilir. Kendi ve arkadaşları (1995) tarafından pregallol ve gümüşnitratın kanla karıştığında reaktifin reaksiyon verme kabiliyetini ortadan kaldırdığı bildirilmiştir. Ayrıca bu reaktif pas lekesi ile de negatif sonuç verir. (2, 6, 13, 17, 19, 24, 31, 32, 33).

4. Orthotolidin Test:

Orthotolidinin, etanol içindeki %4’lük solüsyonu hazırlanarak stok solüsyon elde edilir. Bu solüsyon, +4C’de saklandığında bir ay bozulmadan kalabilir. Bu süre içinde solüsyonda bir miktar dibe çökme görülse dahi, bu onun etkinliğini azaltmaz.

Çalışma solüsyonu, eşit miktarda stok solüsyon ile glasiyal asetik asit ve distile sudan ibarettir.

Testin yapılışı: Bu test iki şekilde uygulanır. Eşit miktarda çalışma solüsyonu ve hidrojen peroksit karıştırılarak ya tüpteki leke ekstratının, ya da süzgeç kağıdına emdirilen leke ekstratının üstüne damlatılır. Yeşil veya mavi rengin meydana gelmesi, pozitif sonuç olarak yorumlanır (6). Cox (1991), bu testte süzgeç kağıdı, koton kumaş ve dilüe kan solüsyonunun 1/100.000’lik dilüsyonunda pozitif sonuçlar elde etmiştir.

5.Luminal Test:

Terkibi;

1g 3-aminofitalhidrazit,

5g Sodyum karbonat,

50 ml 10 volüm’lük hidrojen peroksit

1 lt Distile su’dan oluşan bu solüsyon cam bir atomizere konur.

Test solüsyonu bir yere asılmış veya yayılmış olan lekeli giysi veya kumaşın üzerine karanlık odada atomizer ile spreylenir. Parlak bir görünümün ortaya çıkması, kuvvetle lekenin kan lekesi olduğunu gösterir. Bu testin bir sakıncası, atomizerle spreylenen 300-500 l hacimdeki test solüsyonunun geniş bir alana yayılması ve ilerideki incelemeleri engellemesidir (6). Ancak Laux (1991), test solüsyonu spreylenen lekeli giysi veya kumaşın yaklaşık 30 dakika içinde oda ısısında kuruduğunu ve bu sürenin sonunda ileriki incelemelere geçilebileceğini bildirmiştir.

 

6.Van Dean Reaktifi: 95°'lik alkolde 100 g Gayyak (Gaic) reçinesi eritilip lekeye tatbik edildiğinde, leke kan lekesi ise mavi bir renk verir. Reaksiyonu kolaylaştırmak için terebentin kullanılır. Reaksiyonun hassasiyeti 1/20.000'dir. Bu reaktif tükrük, süt, ter, patates, un, demir sülfat, bakır sülfat, potasyum permanganatla pozitif sonuç verir. İdrar, meni, vajen ifrazı, domates suyu, tentürdiyot, demir, demir klorür, bakır, pas lekesi ile negatif sonuç verir (13, 15, 19, 25, 34).

b) Kat'î Reaktifler

İhtimali reaktiflerle müspet sonuç alındığı ve elde yeterli miktarda materyal bulunduğunda kesin sonuç veren kati reaktiflere geçilir.

Bunlar hemin billurlarının oluşturulması, hemokromojen billurlarının oluşturulması, Heller’in florans deneyi, lekenin spektroskopik muayenesi, pas lekesi ile kan lekesinin ayırımında kullanılan metotlardır.

1)Hemin Billurlarının Oluşturulması: Hemin billurları; Teichmann metodu, Wagennar deneyi, Gabriel Bertrand, Stryzowski reaktifleri ile oluşturulmaktadır.

Teichmann–Hemin Billurlarının Oluşturulması: Eğer leke kazınma tarzında alınmış bir leke ise, kazıntıdan toplu iğne başı büyüklüğünde bir parça, lam üzerine konur, maserasyona tabi tutulmuş bir leke ise, maserasyon mayiinden bir iki damla lama damlatılıp kurutulur. Bu leke üzerine bir lamel kapatılır ve lamelin kenarından bir damla glasiyal asetik asit ile bir damla %1'lik sodyum klorür çözeltisi damlatılıp, kaynatmadan çok hafif bir alev üzerinde tutularak, glasiyel asetik asitle sodyum klorür çözeltisi uçurulur. İyice soğuduktan sonra bu işlem bir kaç defa daha tekrar edilir. Mikroskopta incelendiğinde kahverengi saman çöpü şeklinde görülen billurlar, reaktifin müspet sonuç verdiğini, lekenin kan lekesi olduğunu gösterir. Bu billurlara Hemin billurları denir (2, 13, 19, 26, 31, 33, 34, 37).

Wagennar Deneyi: 1930 yılında Wagennar tarafından bulunmuştur. Bu deneyle Asetonklorhemin billurları oluşturulur. Kırmızı renk farkedilebilecek kadar dilüe leke solüsyonları bile, pozitif sonuç alınması için yeterlidir.

Maserasyona tabi tutulmuş leke dilüsyonundan bir lam üzerine bir damla damlatılır, üzerine bir damla aseton ile bir damla %10'luk hidroklorik asit veya sülfirik asit damlatılarak lam çok hafif bir alevde kaynatmadan kurutmak amacı ile ısıtılır. Oda hararetinde soğumaya bırakılır. Leke kan lekesi ise mikroskobun orta büyütmesinde Teichmann hemin billurlarını andıran daha küçük kristaller görülür.

Gabriel Bertrand Reaktifi:

1 gr Kristalize magnezyum klorür, 5 gr Saf gliserin, 20 cc Glasiyel asetik asit, 1 cc Distile su karıştırılarak reaktif elde edilir.

Bu reaktif çok hassas olup kaynatılmış veya pas ile karışmış, çok eski ve miktarı 0,0005 mg gibi çok az olan kan lekeleriyle bile kesin sonuç verir.

Bir lam üzerine kazınma tarzında ise çok az dilüsyon halindeyse bir damla leke konur. Üzerine bir damla reaktif damlatılıp bir süre bekletildikten sonra mikroskopta hemin billurlarına benzeyen, renkleri sarı–kahverengi arası olan rhomboit şekilli billurlar görülür. Bu billurlara, klor hidrat de hemin billurları denir. Bu billurların görülmesi, lekenin kan lekesi olduğunu gösterir (2, 24).

Stryzowski Reaktifi:

Bu reaktif iki şekilde hazırlanır.

Terkibi:

1) 1 cc Alkol, 1 cc Distile su, 1 cc Glasiyal (asetik) asit, 2 damla İyothidrik asit

2) 1 cc Glasiyal (asetik) asit, 1 cc %25’lik Gomme arebique, 3–5 damla %1’lik Folik asit

Lekeden lam üzerine bir parça konur ve üzerine lamel kapatılır. Lamelin kenarından reaktiflerden herhangi biri sızdırılıp hafif alevde ısıtılırak reaktif uçurulur, soğutularak bu işlem en az üç kez tekrarlanır. Bu reaktif ile mikroskopta 20 mikron uzunlukta koyu kahverengi bir takım kristaller görüldüğünde, lekenin kan lekesi olduğu gösterilmiş olur. Romboid şekilli bu kristallere hematin iyothidrat kristalleri denir (2, 13, 15, 26).

2)Hemokromojen Kristallerinin Oluşturulması: Hemokromojen kristalleri, eski, ısıtılmış, kokuşmuş kan ile de oluşabilmektedir. Şekilleri dikdörtgen, iğne gibi veya iğ biçimindedir (33).

Bunları oluşturabilmek için;

2,5 gr iyot, 0,5 gr potasyum iyodür'ün 25 cc 95º'lik alkolle hazırlanmış eriyiği ile bir damla piridin ve % 2’lik sodyum hidrosülfit'e ihtiyaç vardır.

Eğer leke kazınma tarzında alınmış bir leke ise, kazıntıdan toplu iğne başı büyüklüğünde bir parça lam üzerine konur, maserasyona tabi tutulmuş bir lekeyse, maserasyon mayiinden bir iki damla lama damlatılıp kurutulur, üzerine birkaç damla iyotlu eriyik, bir damla piridin, birkaç damla hidrosülfit konulduğunda leke kan lekesi ise, hemokromojen kristalleri oluşur (25, 37).

Hemokromojen kristalleri Takayama, Oustinov, Sarda–Derrien reaktifleri ile de oluşturulabilmektedir.

Takayama Reaktifi:

Terkibi: 3 cc NaOH % 10

3 cc Glikoz %10

3 cc Pyridin

7 cc Distile su

Maserasyona tabi tutulmuş lekeden, bir lam üzerine bir damla damlatılıp lamel kapatılır. Lamelin kenarından reaktif sızdırılır ve reaktif ile lekenin birleştiği yerde önce sarı, sonra kırmızı renge dönüşen bir renk değişikliği ortaya çıkar. Ardından mikroskopta hemokromojen kristalleri oluşur. Kristaller, bir saat süre ile aynı şekilde gözlenir, daha sonra erimeye başlar ve azalırlar. Bu reaktif, koyu renkli bir şişede 3–4 hafta bozulmadan muhafaza edilebilir (2, 6, 24, 25, 31, 32, 34, 37).

Oustinov Reaktifi:

Terkibi: 3 kısım Pyridin

1 kısım % 20'lik Gomme arabik'dir.

Daha çok kazınma tarzında alınan lekelerde kullanılır. Kazınma tarzında alınan kan lekesinden bir parça, lam üzerine konur ve bir iki damla reaktif damlatılarak lamel kapatılır. Çok hafif bir alevden geçirilip, ısıtılarak kurutulur. Mikroskopta incelendiğinde, kırmızı esmer renkte hemokromogen kristalleri görülür (24).

Sarda-Derrien Reaktifi:

Terkibi: 10 g Baum de Canada

20 g Pyridin

Bulan kişilerin adları ile anılır. Oustinov gibi uygulanır.

Heller'in Florans Deneyi: Bu metot, 1916 yılında Heller tarafından bulunmuştur. Leke materyali dilüsyon şeklinde ise, bir lam üzerine bir iki damla damlatılır. Eğer kazınma tarzında alınmış ise, bir lam üzerine bir parça konulur ve bu leke materyaline bir iki damla konsantre sülfürik asit ilave edilir. Leke kan lekesi ise, kan lekesinin içinde bulunan hematoporfirin parçalanarak porfirin açığa çıkar. Açığa çıkan bu porfirin, mikroskopta incelendiğinde, oldukça yoğun bir florans ve parlak bir görünüm gözlenir.

Bu metot, 1955 yılında Datzaner ve Kednig tarafından modifiye edilmiştir. Lekenin üzerine Tiyoglikol asit ilave etmişler ve hematoporfirin içindeki demiri parçalayarak ortaya çıkan porfirin ile aynı floransı elde etmişlerdir.

3) Lekenin Spektroskopik Muayenesi: Bu tetkikten sonuç alınabilmesi için, en azından narçiçeği görünümünü almış leke solüsyonu gereklidir. Daha açık renkli bir solüsyonla sonuç alınamaz. Şeffaf bir kap içine konulan leke solüsyonu, spektroskopla incelendiğinde leke eğer kan lekesi değilse, spektroskopla görülen renkler arasında hiçbir değişiklik olmaz. Kan lekesinde ise, spektroskoptaki sarıyla yeşil rengin birleştiği yerde, D ve E bandları arasında, soldaki sağdakine göre hafif genişçe yukarıdan aşağıya uzanan absorbsiyon bandı adı verilen iki siyah çizgi görülür (2 13, 19, 24, 25, 26, 37).

4) Pas Lekesi ile Kan Lekesinin Ayırımı: Pas lekesi suda erimez, süzgeç kağıdı ıslatılıp lekeye sürüldüğünde, pas lekesi kağıda çıkmaz. Buna, Taylor izi negatiftir denir. Pas lekesi KOH'ta erimez, HCl'de erir. % 65 Potasyum Ferrosiyanür ile Prusya mavisi rengindeki çöküntü, pas lekesi ile oluşur. Bu çöküntü, okzalik asitte erir. Pas lekesi, tanenle siyah renk verir. Mayer reaksiyonu pas ile negatif, Adler reaktifi ise, pozitif sonuç verir (25).

İnsan ve Hayvan Kanı Ayırımı

Lekenin kan lekesi olduğuna karar verildiğinde, grup tayinine geçmeden önce insan kanı olup olmadığının araştırılması gerekir. Takayasu ve arkadaşları (1988) şempanzeler üzerinde yaptıkları araştırmada insan A1 antijeni ile şempanzelerdeki A antijeninin aynı serolojik özelliğe sahip olduğunu göstermişlerdir. Bunun için de sitolojik metotlar (kan boyama preparatlarının hazırlanması, lökosit sayılması) ve immünolojik metotlar (presipitan serum-tüp tekniği, kapiller test, agar-gel diffüzyon testi ve antiglobülin human test) uygulanır (37).

a) Sitolojik metotlar.

Kuşların ve balıkların alyuvarlarının çekirdekli olduğu, insan ve memeli hayvan alyuvarlarının ise, çekirdeksiz oldukları pek eskiden beri bilinmektedir. Taze lekelerden hazırlanan preparatlar, kan boyama metotları ile boyandığında alyuvarların çekirdeksiz oldukları tespit edilirse, insan kanı lekesi olduğu düşünülebilir. Ayrıca lökosit formülü yapılarak sonuç doğrulanabilir (2, 26, 32, 37).

b) İmmünolojik Metotlar

Bunlar presipitasyon ve aglütinasyon esasına dayanan testlerdir.

1) Presipitasyon Esasına Dayanan Testler:

Presipitasyon: Basitçe, suda erimiş antijenlerin, elektrolitli ortamda kendi immunoglobulinleri (antikorları) ile birleşmeleriyle önce bulanıklık, sonra bir çökme olayı şeklinde sonuçlanan reaksiyona presipitasyon denir. Önceleri tüpte iki sıvının belli miktarlarda karıştırılması ile uygulanan ve pek kısıtlı kullanma alanı bulunan, mikrobiyolojinin değerli bir serolojik testi olan presipitasyon, hergün yeni tekniklerin ortaya konması ile gittikçe genişleyen bir uygulama alanı bulmuş ve Adli Tıbbın da önemli testleri arasına girmiştir (4, 37).

Presipitasyon için presipitan seruma ihtiyaç vardır. Tavşanların karın derisi altına, peritona veya kulak venine 20 gün boyunca 3–4 gün aralıklarla, her defasında 3–4 ml olmak üzere, steril insan veya hayvan serumu enjekte edilir. Tavşanların 1/3'ünün kanında, enjekte edilen seruma karşı antikor oluşur. Tavşanlar son enjeksiyondan sonra 24 saat aç bırakılarak kanları alınır ve serumları titre edilerek presipitan serum elde edilir (13, 26, 31, 37).

Presipitasyonun Çeşitli Uygulama Alanları:

Halka Deneyi: Basit olarak bir bağışık serumda, belli bir antijene karşı antikor olup olmadığını ya da bir sıvıda belli bir antikora karşı antijen olup olmadığını, kalitatif olarak anlamak mümkündür. Bu metot, bazı besin maddelerinde bulunan yabancı proteinlerin (sucuklarda uygunsuz etlerin), bazı kuşkulu lekelerin insan ya da hayvan kanı olup olmadığının anlaşılması gibi konularda uygulanabilmektedir

İnce bir tüp içerisine az bir miktar bağışık serum konur. Üzerine iki sıvı karışmayacak ve tabakalaşacak şekilde tüp 45 eğilip damlalığın ucu tüpe değdirilerek yavaşça antijen eriyiğinden eklenir. Eğer ortamda birbirine uygun antijen ve antikor bulunuyorsa bir süre sonra iki sıvının birleştiği yerde beyaz bulut görünümünde bir presipitasyon halkası oluşur. (4, 20, 38).

Tüp Tekniği: Adli tıp pratiğinde presipitasyon için, tüp tekniği tercih edilmektedir. Presipitan serumla kan lekesinin, insan kanı olup olmadığının araştırılması, kan serumu içindeki proteinlere istinad eder (37).

Lekeli kumaşın lekeli kısmından bir parça, lekesiz kısmından da aynı büyüklükte diğer bir parça kesilerek ayrı ayrı tüplerde ekstraksiyona tabi tutulur. Taze lekeler birkaç saat içinde çözülebilirler. Acil bir durum olmadığında en iyisi materyallerin buzdolabında +10ºC'da 48 saat süreyle ekstrakte edilmeleridir. Bu süre içinde leke çözülmezse ekstrakt biraz ısıtılabilir. Her iki ekstrakt kuvvetlice santrifüj edilip üstte kalan kısım başka tüplere aktarılır. Ekstraktlar içindeki albümin miktarı 1/1000 veya daha fazlaysa presipitasyon meydana gelmeyebilir. Bu nedenle her iki ekstrakt 1/10 oranında dilüe edilir. Bir port tüpe dizilen 6 adet Uhlenhut veya Schiff-Holzer tüpleri numaralanır. 1. tüpe lekeli yerden hazırlanan ekstraktan, 2. tüpe bu ekstraktın 1/10 oranında dilüe edileninden, 3. tüpe lekesiz yerden hazırlanan ekstraktan, 4. tüpe 1/1000 oranındaki insan serumundan, 5. tüpe 1/1000 oranındaki sığır serumundan, 6. tüpe lekeli yerden hazırlanan ekstraktan 3–4 damla konulduktan sonra tüpler hafifçe eğilerek kenarından 1–2–3–4-5. tüplere 2–3 damla Anti human presipitan serum 6. tüpe Anti sığır presipitan serum ilave edilir. Eğer 1., 2. ve 4. tüplerde 5 dakika içinde anti serum ile ekstraktın birleştiği yerde beyaz renkte bir halka meydana gelir ve 10 dakika süreyle 3., 5. ve 6. tüpler berrak olarak kalırsa araştırılan kan lekesi insan kanı lekesidir.

1. ve 2. tüplerde reaksiyon meydana gelmeyip 4. tüpte reaksiyon meydana gelirse incelenen kan lekesinin insan kanı lekesi olamayacağı söylenebilirse de bu durum kan lekesinin azlığından yani leke içerisindeki protein miktarının yetersizliğinden de kaynaklanabilir. Lekenin kırmızı renkte olmasına güvenmemelidir. Çünkü burada reaksiyonun meydana gelişini sağlayan kan lekesinin serumudur. Kan lekeleri içindeki protein, lekenin ısıtılmasına ve tefessühüne (kokuşmasına) ileri derecede dayanıklı olmasına rağmen lekenin kaynama noktasına kadar ısıtılmasında tahrip olabilir. Ayrıca protein çöktüren kimyasal maddelerden pas ve kireç ile karışması halinde negatif serolojik sonuçlar alınabilir. Böyle bir durum karşısında kan lekesinin protein içerip içermediğini kontrol etmek için sülfosalisilik asit kullanılır: Bir miktar serum fizyolojik ile bıçak ucu kadar sülfosalisilikasit karıştırılarak elde edilen solüsyon araştırma yapılan lekenin üzerine damlatıldığında beyazımtırak renkte bir bulanıklık meydana gelirse bu leke içerisinde protein varlığını gösterir. Bu durumda da proteinin insana ait bir protein olmadığı anlaşılır ve leke insan kanı lekesi değildir denir.

Eğer 1., 2., 4. ve 5. tüplerde aynı anda reaksiyon meydana gelirse anti human serumun kullanılamayacak hale geldiğine karar verilerek yeni bir serumla deneyi tekrar etmek gerekir.

Eğer 1., 2., 4. tüplerle birlikte 3. tüpte de reaksiyon meydana gelirse, kumaşın daha önce yıkandığı temizleyici maddelerden iyice arınmadığı düşünülür. Eşit miktarlarda karıştırılarak hazırlanan etil alkol, metil alkol, anil alkol, triklorethylen karışımı ile lekeli kumaş birkaç saatlik ekstraksiyona tabi tutularak söz konusu yabancı maddeler uzaklaştırılır (37).

Huber'in Modifiye Presipitasyon Testi: Bir lam üzerine, yan yana bir damla anti human presipitan serum, bir damla da araştırılacak olan kan lekesi ekstraktından damlatılıp, lamel kapatılır. Mikroskopta incelendiğinde iki zon arasında beyaz çizgi şeklinde bir reaksiyon gözlenir. Normal mikroskopla görmek her zaman mümkün olmadığından, incelemenin karanlık saha mikroskobuyla yapılması, bu bandı açıkça görmeyi sağlar.

Kapiller test: Bu test, tüp testinin yüz defa küçültülmüş şeklidir. Çok az miktardaki lekeler üzerine uygulanabildiği gibi, serum tasarrufunda da bulunulmuş olur. Bir ml antiserumla 10–15 inceleme yapılabilmektedir. 20 cm uzunluğunda 2,5 mm. çapında kalın cam kapillerler kullanılır. Kapillerlerin alt ucundan aralarında ufak bir hava kabarcığı bırakılarak önce ekstrakt daha sonra anti serum emdirilir. Kapillerlerin alt uçları bir parça plastin ile kapatılarak kapillere parmakla hafifçe vurup hava kabarcığı çıkarılarak ekstraktla serumun teması sağlanır. 2–3 dk sonra siyah bir fon ve kuvvetlice bir ışık karşısında presipitasyonun oluşup oluşmadığı kontrol edilir (37, 38).

Agar-Gel Diffüzyon Testi: Bu test, santrifüj yoluyla iyice berraklaştırılamayan kan lekeleri için tercih edilen bir metottur. Ayrıca reaksiyonun uzun müddet devam etmesi ve saklanabilmesi gibi avantajları da vardır

Bir petri kutusu içine 2–3 mm kalınlığında % 1,5 agar çözeltisi dökülür. Soğutulduktan ve hafif katılaştıktan sonra bir mantar delicisiyle tam ortasında 3–5 mm çapında bir delik ve etrafına da 1 cm çapında dört delik daha açılır. Ortadaki deliğe anti human presipitan serum, diğer deliklere de kontrol için ekstraktın çeşitli dilüsyonlarından konulur. Aynı büyüklükteki diğer bir petri kutusunda hazırlanan agar çözeltisine de aynı delikler açılarak ortadakine incelemesi yapılan ekstrakt, soldakine anti human, alttakine anti sığır, sağdakine anti domuz presipitan serumları konularak agar gel plaklarının delikleri karşılıklı gelmek üzere üst üste konur ve 1–3 gün süreyle buzdolabında bekletilir. Pozitif reaksiyonun oluştuğu ortadaki deliğin etrafında halka şeklinde koyu renkli bir bulanıklığın belirmesiyle anlaşılır (37).

2)Aglütinasyon Esasına Dayanan Testler

Aglütinasyon: Antikorların, birden fazla antijenik hücre ile, antijenik hücrelerin de, birden fazla antikorla birleşmesi sebebiyle eritrositlerin biraraya toplanmasına aglütinasyon denir. Biraraya toplanan bu eritrositler gözle, büyüteçle veya mikroskopla görülebilir. Aglütinasyon olayının gerçekleşebilmesi için, antijeni taşıyan hücrelerin elektrolitli ortamda (serum fizyolojikte) süspansiyon halinde bulunmaları gerekir (4).

Coombs testi, Anti–human globulin testi, Pasif hemaglütinasyon testi, Leke içinde anti–ark aglütininlerin varlığı esasına dayanan metotlar bu testlerden bazılarıdır.

Coombs Testi: Bu test, 1949 yılında Wiener tarafından geliştirilerek Adli Tıp alanında insan kanı ile hayvan kanı ayırımı için kullanılmaya başlanmıştır. Coombs serumu, eritrositlerin etrafını kaplayan inkomplet Rh antiserumunun ortaya çıkarılmasında kullanılır. İnkomplet Rh antiserumu ile kaplanıp aglütinasyon vermeyen eritrositlerin üzerine bir damla anti–human globulin serum (Coombs serumu) damlatıldığında, anti globulin molekülleri hassaslaştırılmış olan eritrositleri aglütine ederler (4).

Anti–Human Globulin Test: Jungwirth, 1956'da anti human globulin serum ile insan proteinlerinin biraraya gelmesi sonucunda Coombs serumunun nötralize olması, yani aktivitesini tamamen kaybetmesi özelliğinden yararlanarak bu metodu geliştirmiştir.

Bu testin tercih nedeni, bulanık ekstraktların temizlenmesine gerek kalmaması, tüp testinden kolay, çabuk ve onun kadar hassas olmasıdır.

O grubu Rh(+) kan eritrositleri Anti H serumu ile yarım saat 37ºC'de inkübe edilir. Üç defa serum fizyolojikle yıkanarak %5'lik süspansiyonu hazırlanır. Coombs serumunun 1/50'lik solüsyonundan bir tüpe veya bir lama bir damla konur. Bir damla da leke ekstraktından damlatılıp karıştırılır, 5 dk bekletilir. Üzerine eritrosit süspansiyonundan bir damla damlatılır, 5–10 dk bekletilip aglütinasyon meydana gelip gelmediğine bakılır. Eğer aglütinasyon meydana gelmemişse araştırılan leke insan kanı lekesidir (37).

Pasif Hemaglütinasyon Testi: Eritrositler, tanen ile muamele edilir ve globulin içeren insan serumundaki proteinle bağlanma kabiliyeti kazandırılır. Bu globuline bağlanma özelliği kazanan eritrositlerden bir tüpe bir damla konur ve üzerine anti human globulin serum eklenir. Aglütinasyon meydana gelmiş ise, leke insan kanı lekesidir (6).

Leke İçinde Anti–Ark Aglütininin Varlığı Esasına Dayanan Metot: Bu metot Markx, Ehren ve Roorh tarafından bulunmuştur. Araştırılan kan lekesinin % 0,6'lık serum fizyolojik ile oldukça konsantre bir solusyonu hazırlanır. Bundan lama bir damla damlatılır. Parmak ucundan direkt olarak alınan kandan bir damla ilave edilir, aglütinasyon meydana gelmiş ise, leke insan kanı lekesi değildir. Çünkü bu aglütinasyonun oluşumuna neden olan anti–ark aglütinin, bir çok hayvanın serumunda da bulunmaktadır (37).